После окончания школы Глушенко собиралась поступать в педагогический вуз. Театральный руководитель, узнав об этом, решила выяснить причину отказа Евгении от карьеры актрисы. В итоге педагог помогла Евгении подготовиться к вступительным экзаменам в театральный. Глушенко с первого раза сдала экзамены и поступила в Ростовский театральный институт. Проучившись в институте всего год, Евгения поняла, что хочет достичь большего, и поехала в столицу. В Москве Глушенко подала документы во все театральные вузы. Первыми о зачислении сообщили ей из Щепкинского училища.
В 1974 году Евгения Константиновна окончила Высшее театральное училище имени М.С. Щепкина и в том же году была принята в труппу Малого театра на роль Лизы в «Горе от ума». С 1996 по 2000 год – актриса Театра Российской армии. В 2000 году вернулась на сцену Малого театра.
Евгения Глушенко сыграла множество ролей в спектаклях по русской и зарубежной классике. Актриса может на сцене буквально всё – нет такого жанра или психологического типа, который она не сумела бы воплотить. В галерее характеров, созданных Евгенией Глушенко, трагические героини соседствуют с находчивыми весёлыми субретками, а сильные волевые женщины – с наивными простушками.
В кино Евгения Глушенко дебютировала в 1968 году в короткометражке «А я уезжаю домой». Первая большая роль в полнометражном фильме состоялась в 1977 году – актриса сыграла Сашеньку Платонову в кинокартине «Неоконченная пьеса для механического пианино». В том же году снималась в роли Евы в новелле «Большая любовь Чередниченко Н.П.» киноальманаха «В профиль и анфас».
Евгения Глушенко известна зрителям благодаря таким фильмам, как «Несколько дней из жизни И. И. Обломова», «Впервые замужем» (1979), «Влюблён по собственному желанию», «Не ждали, не гадали!» (1982), «Уникум» (1983), «Зина-Зинуля» (1986), «Полицейские и воры» (1997), «Три женщины и мужчина» (1998), «Тёмные аллеи» (2004), «Живи и помни» (2008). На счету актрисы участие в сериалах «Жизнь Клима Самгина» (1987), «Королева Марго» (1997), «Зал ожидания» (1998), «С новым счастьем!» (1999), «Группа счастья» (2011) и многие другие.
Евгения Глушенко – народная артистка России. В 2003 году актриса награждена орденом Дружбы, в том же году Евгении Константиновне присуждена Государственная премия России. Актриса – лауреат многих российских и международных кинофестивалей и театральных премий.
Артистическую деятельность Евгения Константиновна совмещает с преподаванием актёрского мастерства в Щепкинском училище.