В 1921-1929 годах учился в Ленинградской средней школе № 68, в 1928-1929 - в Ленинградской частной художественной студии Н.Н. Ходотова. В 1930 году окончил актёрское отделение Ленинградского художественного политехникума.
В 1930-1934 годах - актёр Ленинградского «Театра актёрского мастерства» под руководством Л.С. Вивьена, в 1934-1938 - Государственного театра им. Вс. Мейерхольда (ГосТИМ) в Москве, в 1938-1939 - Киевской киностудии (ныне Киностудия имени А. Довженко), в 1939-1940 - Московского театра Комедии, в 1940-1967 - Театра Революции (с 1954 - Московский драматический театр им. Вл. Маяковского), с 1968 - Малого театра.
Во время Великой Отечественной войны, в 1941-1942 годах - актёр Тбилисской киностудии (ныне «Грузия-фильм»), в 1942-1943 - Ереванской киностудии (ныне «Арменфильм»).
Родители актёра погибли от голода в блокадном Ленинграде.
В кино с 1936 года. Дебютной стала роль инструктора физкультуры Гриши Рыбина в фильме «Случайная встреча». Затем в том же году последовали роли доктора Робинзона и адвоката Робинзона в фильме «Том Сойер».
Первые роли в кино принесли Евгению Самойлову скорее разочарование, чем удовлетворение. К 1936 году театральный актёр успел сыграть и Чацкого в «Горе от ума», и Гришку Отрепьева в «Борисе Годунове». Артисту театра Всеволода Мейерхольда претила легкомысленность киноцеха.
Но 1939 году поступило предложение от прославленного режиссёра Александра Довженко, и роль полковника Николая Щорса в одноимённой ленте не только открыла кинозрителям актёра Самойлова, но и проложила для него дорогу в кинематограф.
На протяжении более 70 лет талант Евгения Самойлова раскрывался как на театральных подмостках, так и перед камерой.
Евгений Самойлов известен широкому кругу кинозрителей по таким фильмам, как «Светлый путь», «Сердца четырёх», «В шесть часов вечера после войны», «Неоконченная повесть», «К Чёрному морю», «Ватерлоо», «Крушение империи», «Звёзды не гаснут», «Они сражались за Родину», «Берег его жизни», «Борис Годунов» и многим другим.
Любовь Евгения Самойлова к кино передалась и его детям – дочь Татьяна и сын Алексей Самойловы также стали актёрами.
Последнюю роль актёр сыграл на 91-м году жизни.
Умер Евгений Валерианович 17 февраля 2006 года в Москве. Похоронен на Ваганьковском кладбище.